ÖNSÖZ Doğadaki mantar türlerinin kültüre alınması yetiştiriciliği, hobi veya ticari olarak üretimi, insan beslenmesinde, biyolojide, tipta vb. değişik bilim dallarında, akademik çalışma alanlarında kullanımı her zaman güncel bir konu olmuştur. Uzakdoğu ülkelerinde yüzyıllardır yetiştirilen Shiitake bu ülkelerde yaşayan insanların günlük sıradan yiyecekleri arasındadır. Kendine özgü hoş kokusu ve besin değerinin yanında, tıp alanında kullanımının anlaşılmasıyla yetiştiriciliği kısa sürede bütün dünya Ülkelerinde yaygınlaşmış ve özellikle son 10-15 yıl içinde üretimiyle tüketimi büyük rakamlara ulamıştır. Ülkemizde sadece beyaz şapkalı mantarın kültürü yapılmaktadır. Bunun dışında halkımız yaşadığı bölgede yöresel olarak bildiği, tanıdığı mantarları doğadan toplayarak tüketmekte, ancak dünya piyasasında önemli bir yer tutan egzotik mantar türlerini tanımadığından yetiştiriciliklerine yönelik herhangi istikrarlı bir girişimde bulunmamaktadır. Bu kitap, halkımıza Shiitake mantarını tanıtmak ve yetiştiriciliğinin nasıl yapıldığını açıklamak üzere hazırlanmıştır. Eserin tarımımıza, amatör veya profesyonel olarak Shiitake yetş§tiriciliği ile ilgilenecek herkese faydalı olmasını umut ediyorum. l.GİRİŞ Heterotrof organizma olan mantarlar, doğada biyolojik dengenin sağlanmasında çok büyük önem taşımaktadır. Mantarlar doğada bakterilerle birlikte hayvansal ve bitkisel atıkları parçalayarak ayrıştırmakta, böylelikle yeryüzündeki organik madde yığınlarını ortadan kaldırmaktadırlar. Bu faaliyet sonucu ayrışma ürünleri toprağın besin değerini yükseltmekte, fiziksel yapısını iyileştirmekte, mikroorganizma popülasyonunu çoğaltarak toprak verimliliğini arttırmaktadır. Parçalama işlemi sırasında açığa çıkan karbondioksit, bitkilerin fotosentez işlemi için gereklidir. Diğer taraftan mantarlar insan ve hayvan beslenmesinde yaygın olarak kullanılırken tıp alanında da mantarlardan geniş ölçüde yararlanılmaktadır. Dünya üzerinde toprak, su ve havada, daha doğrusu hemen hemen her yerde biçim ve boyutları gözle görülemeyecek kadar küçük ve ilkel olanlarından çok gelişmiş olanlarına kadar 1.5 milyon fungus türünün varlığından bahsedilmektedir. Bu sayı içerisinde günümüze kadar 69.000 tür net olarak tespit edilmiş ve tanımlanmıştır. 69.000 tür içerisinde 10.000’i makro fungus olarak değerlendirilmekte; bunlardan 5020 adedinin yenilebilir, 1820’sinin tıp alanında kullanıldığı, 1010 tanesinin zehirli, 2150’sinin ise zehirli olmayıp ancak yenilebilir nitelik taşımadığı belirtilmektedir. Yenilebilir 5020 tür içerisinde 5 tanesi endüstriyel anlamda yetiştirilirken, 22 tanesinin ticari anlamda kültürü yapılmakta, yaklaşık 120 türün ise ekonomik anlamda yetiştiriciliği yapılmak üzere çalışmalar devam etmektedir (Chang 1993). Günümüzde bütün dünyada en fazla yetiştiriciliği yapılan tür beyaz şapkalı mantardır (Agaricus bisporus). Bu mantar 6 milyon tonluk dünya üretiminde %30’luk bir payla ilk sırayı almaktadır (Poppe 2000, Anonim 2002a). Kültürü yapılan mantar türleri arasında SHIITAKE (Lentinula edodes (Berk.) Pegler) gerek besin değeri ve lezzeti gerek tıp alanındaki kullanımıyla uluslararası bir üne sahiptir. Shiitake daha çok Doğu Asya ülkelerinde üretilmektedir. En önemli iki üretici ülke Çin ve Japonya’dır. Her iki ülkede de yetiştiriciliği bir sanat dalı olarak kabul edilmekte, yetiştirme yerlerine bir mabede gider gibi gidilmektedir. Yetiştiriciliğinin yaygın olarak yapıldığı diğer ülkeler Tayvan, Kore, Filipinler, Singapur, Burma, Borneo ve Papua Yeni Gine’dir. Shiitake ürerimi özellikle 2.dünya savaşından sonra artmıştır. Ancak esas artış 1974 yılında gerçekleşmiştir. Mantarcılık kongresinin Tokyo ve Tayvan’da gerçekleştirilmesiyle Shiitake ile beraber uzakdoğu kökenli birçok türün dünyaya tanıtılması sağlanmış ve egzotik olarak kabul edilen birçok mantar türünün üretimi Avustralya, Amerika ve Asya kıtalarında hızla yaygınlaşmıştır. 1936 yılında 18.000 ton olan Shiitake’nin dünyadaki üretimi 1986’da 314.000 tona, 1997de ise 1.573.000 tona yükselmiştir (Royse 1985, Chang 1987, Royse ve Sanchez-Vazques 2000). Günümüzde dünya piyasalarında 1 kg taze Shiitake 10 ile 20 $, 1 kg kurusu ise 20 ile 80 $ arasında işlem görmektedir. Diğer taraftan kurutulup toz haline getirilmiş veya etkili maddelerinin bulunduğu Shiitake kapsülleri ilaç gibi tamamen doğal ürünlerin satıldığı firmalarca tazesinden çok daha yüksek fiyatlarla pazarlanmaktadır Ülkemizde Shiitake yetiştiriciliğine yönelik ilk çalışmalar, 1987 yılında Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi’nde başlamıştır. 1989-1991 yıllarında yaptığımız ilk eserlerle beraber (İlbay ve Ağaoğlu 1989 Ağaoğlu ve ark. 1990, Ağaoğlu ve ark. 1991) bu konuda yapmış olduğum doktora çalışmam ve çeşitli makalelerimde konunun önemi vurgulanmış, yetiştiricilik koşulları ortaya konmuştur. Bununla beraber mantar terimi ülkemizde temel değil, alternatif bir gıda maddesi ve ormancılık sektöründe de tali ürünler arasında değerlendirilmiş, üretim sadece beyaz şapkalı mantarla sınırlı kalmış, diğer bir deyişle 2000’li yıllara kadar ticari ve ciddi anlamda Shiitake üretimi yapılmamıştır. Ancak son 1-2 yıl içerisinde birkaç firmanın Shiitake yetiştiriciliği konusunda girişimleri yine de sevindiricidir. 2. TARİHÇESİ Shiitake, şii ağacı (huş) mantarı anlamına gelip, şii ağacının devrik kütükleri bu mantarın konukçusudur. Shiitake ingilizcede ise “Mantarı Şii ağacından topla” anlamında kullanılmaktadır. Doğada geniş bir alana yayılmış olsa bile bu mantarın yabani formları yalnızca Asya kıtasının tropik alanlarında görülebilmekte, Çin, Japonya, Tayvan, Himalaya dağları, Borneo ve Papua Yeni Gine’de bölgelere adapte olmuş birçok değişik tipleri bulunmaktadır. Singer (1961), 2000 yıl önce Shiitake’nin Çin ve Japonya’da kültürünün yapıldığını, yabani Shiitake’lerin ormandan toplanarak tüketildiğini belirterek, Japonya’da 199 yılında imparator Chuai için Kyushu yerlilerinin mantar topladığını bildirmektedir. Uzakdoğu Asya ülkelerinde beyaz şapkalı mantardan çok daha fazla sevilen Shiitake’ye hoş kokusu ve lezzetinden dolayı çok değer verilmekte, “imparatorların yiyeceği” olarak anılmakta, uzun yaşamanın sırrı, doğal bir şifa kaynağı olarak satılmakta ve geleneksel olarak düğün yemeklerinde kullanıldığı gibi afrodizyak etkisi olduğuna inanılmaktadır. Shiitake’nin yetiştiği yere yakın yaşayan Samurai savaşçıları bu mantarı başkalarının toplamasını yasaklamışlardır. 1313 yılında Çinli araştırıcı Wang “Tarımın Kitabı” adlı eserinde günümüzde hala kullanılmakta olan kütük kültürünün esaslarından bahsetmiştir. Farmakolojik etkisi ise Ming Hanedanı (1368-1644) dönemine kadar eski dönemlerde Wu Shui adlı ünlü bir doktor tarafından bahsedilmiş ve Shui Shiitake’nin insanlara dinçlik ile enerji verdiğini ayrıca beyin kanamakrının tedavisiyle önlenmesinde etkili olduğunu ileri sürmüştür (Ito 1978, Leatham 1982, Lin ve ark. 2000). 1910 yılında Shiitake spor süspansiyonunun baltayla açılmış kertiklere enjeksiyonuyla sağlanan yüksek inokulasyon başarısının yanında, 1920 yılında K.Kitayama ve 1943 yılında Kyoto Üniversitesinden Kisaku Mori adlı araştırıcılar mantar sporlarını “tanegoma” adı verilen steril odun parçaları üzerinde geliştirmişler, böylelikle saf mantar kültürü ile sarılmış yongaların kütüklerdeki balta yaralarına veya açılan deliklere aşılanması yoluyla modern üretim sistemleri de gelişmeye başlamıştır.(Ito 1978, Leatham 1982, Royse ve ark. 1985). Shiitake’nin suni ortam üzerinde yetiştirilmesine ait ilk çalışmalar 1929 yılında başlamıştır. 1933 yılında Passecker şişe içinde sterilize ettiği kayın ağacı talaşına Shiitake miseli aşılamış ve primordium formasyonu için ışığın gerekliliğinden bahsetmiştir (Royse ve ark. 1985). Geçen yüzyılda Shiitake’nin suni ortamlarda (katı ve sıvı) yetiştiriciliğine, sitolojisi ile genetiğine ait çok sayıda çalışma yapılmış ve birçok konu açıklığa kavuşturulmuştur. unumuz le Shiitake (Lentinula edodes)’nın endüstriyel anlamda yetiştiriciliğinde artık bütün dünyada en fazla polipropilen torbalara doldurulan talaşın sterilizasyonu esasına dayanan bir teknik kullanılmaktadır. 1970’li yıllarda Tayvan’da geliştirilen bu teknik ancak 1980li yıllardan sonra kullanılmaya başlanmış ve kısa sürede hızla yaygınlaşarak özellikle geçen 10-15 yıllık bir süre içerisinde dünyada büyük bir üretim artışına neden olmuştur 3. İNSAN BESLENMESİNDEKİ ÖNEMİ Uzakdoğu Asya ülkelerinde temel besin maddeleri arasında yer alan Shiitake’nin sakız gibi aromatik ve sarımsak gibi tadı bulunmakta, pişirildiğinde orijinal rengini koruduğu gibi yemeğe hoş kokulu bir lezzet vermekte, meşe ağacının kendine özgü hoş kokusu belirgin bir sekilde hissedilebilmektedir. Bünyesinde bulunan guanosineo-5 monophosphato, Lenthionine (Şekil 3.1) ve sülfür bileşikleri Shiitake’nin aromasını oluşturmaktadır. Diğer taraftan kolaylıkla kurutulabilmekte ve kurutma işlemi mantarın aromasını yükseltmektedir. Kurutulmuş mantar, bünyesine kolaylıkla su çekmekte ve taze haliyle aynı bir görünüm sağlamaktadır. Shiitake fiziksel zedelenmeye karşı oldukça dayanıklıdır ve buzdolabında iki hafta kadar bozulmadan kalabilmesi dünya piyasasında popülerliğini her geçen gün daha da arttırmaktadır(Wada ve ark. 1967, Ito 1978, Lee 1980, Chen ve Ho 1986). Shiitake protein, vitamin ve mineral maddeler bakımından oldukça zengin bir mantar türüdür. 100 g taze mantar yenildiğinde ancak 28 kalori alınır ki bu da iyi bir diyet yemeği olduğunu göstermektedir. Lentinula edodes insan beslenmesi için gerekli bütün temel amino asitleri içerdiği gibi, ham külü içindeki P, Fe ve Ca kemik ile dişlerin gelişmesinde rol oynamaktadır. İçerdiği B vitaminleri (B1, B2, B12) gelişmeyi düzenler, C vitamini ise skorbit tedavisinde ve önlenmesinde etkilidir. Az miktarda A ve E vitamini de içeren mantarın bünyesinde yüksek düzeyde bulunan ergosterol (provitamin D2) güneşin ultraviyole ışığında veya suni ışıkta D2 vitaminine dönüşmektedir. D2 vitamini ise kemik ve kas gelişimine yardım ettiği gibi lenf ile raşitizim hastalığının çıkışını engellemekte, vücutta fosfor ve kalsiyum düzeyini dengelemektedir. 1 g kuru Shiitake 400 IU D2 vitamini içermektedir (IU=0.0003 mg). Bu da bir insanın günlük ihtiyacını karşılamaktadır (Chrisan ve Sands 1978, Lee 1980, Rovse ve ark. 1985). Yenebilir mantarların besin içerikleri incelendiğinde; insan beslenmesinde çeşitli sorunlara yol açan yağ ve karbonhidrat miktarının son derece düşük olduğunu görmekteyiz. Genel anlamda günlük ortalama 200-250 g mantar tüketilmesi, protein miktarı bakımından 100 g hayvansal gıdayla alman protein miktarıyla eşdeğer nitelik taşımaktadır. Diğer taraftan mantar proteinin %80- 90’ının insan tarafından hazmedilebilmesi, buna karşın ette bu oranın daha düşük olması (%30-40) ve bitkisel proteinin insan bünvesinde hayvansaI proteinlerin yarattığı sakıncaları oluşturmaması, mantarların önemini açıkça ortaya koymaktadır. Shiitake besin değerinin yanında tıbbi özellikleri bakımından da oldukça dikkat çekici bir mantardır. Asya ülkelerinde doğal bir sağlık maddesi, folklorik bir ilaç olarak değerlendirilmekte, afrodizyak etkisinin olduğuna inanılmakta, tıbbi açıdan Ganoderma lucidium’la beraber mantarların lideri kabul edilmektedir. Bilimsel olarak yapılan çok sayıda araştırmada Shiitake’nin kan dolaşımını düzenlemesi, beyin kanamalarının, damar sertliğinin, böbrek yetmezliğinin, yüksek tansiyonun önlenmesinde etkili olduğu, antibakterlyel, antifungal, antiviral özelliklerinin yanında ayrıca romatizma, soğuk algınlığı, mide ve baş ağrısını, hepatit (B) hastalığını iyileştirdiği, halsizliği ortadan kaldırarak uykusuzluğu giderdiği, bağışıklık sistemini güçlendirdiği bildirilmektedir (Yamamura ve Cochran 1974 a,b, Cochran 1978, Anonim 1999, Ooi 2000, Anonim 2002b, c). Yapılan araştırmalarda Shiitake’de bulunan “Eritadenine” adlı bileşiğin kandaki kolesterol oranını %25 ile 45 oranında azalttığı tespit edilmiştir (Tokudo ve ark. 1974, Tautorus 1985, Anonim 1999, Anonim 2002 c). Günümüzde Shiitake antitümör aktivitesinden dolayı ciddi anlamda kanser tedavisinde kullanılmak üzere çok sayıda ülkede bir çok araştırma programında yer almaktadır. Japonya’da bu mantardan 50 kadar enzim ekstrakte edilmiştir ve bunlardan pepsin ile trypsin mide tedavisinde, asparaginase ise çocuklarda görülen kan kanserinin iyileştirilmesinde kullanılmaktadır. Diğer taraftan bünyesinde bulunan “Lentinian” adı verilen bir polisakkaritin “Sarcoma 180” denilen katı tip tümörlerin gelişmesini durdurabilmesi dünyada bu mantara verilen önemi daha da arttırmıştır ve kemoterapi sırasında hastaların Shiitake’yi gıda olarak tüketmeleri tavsiye edilmektedir. Son yıllarda Lentinula edodes’in AİDS tedavisinde kullanılmasına yönelik yoğun çalışmalar da yürütülmektedir (Stamets and Chilton 1983, Tautorus 1985, Anonim 1999, Ooi 2000, Anonim 2002 b, c, d). 4. SINIFLANDIRILMASI, MORFOLOJİSİ VE YAŞAM DÖNGÜSÜ 4.1. Sınıflandırılması Shiitake mantarının bilimsel adı Lentinula edodesdir ve Hymenomycetes sınıfının, Tricholomatales takımı, Pleurotaceae familyasına dahildir. Çeşitli kaynaklarda bir çok sinonimine rastlamak mümkündür(Lentinus edodes, Lentinula edodes shiitake, Cortinellus edodes, Cortinellus shiitake, Cortinellus berkeleyanus, Armillaria edodes vb.). Ülkeler bu mantarı konuştukları dillere göre değişik şeklide adlandırmaktadırlar İngilizce: Japanese forest mushroom Fransızca: Lentin du Japon Almanca: Shiitakepilz İtalyanca: Fungo Cinese İspanyolca: Seta japonesa Japonca: Shiitake Korece: Pyogo Bununla beraber batılı ülkelerde esas olarak “she-e-ta-kav” olarak ta tanınmakta ve telaffuz edilmekte, ülkemizde ise Çin veya Japon, meşe, orman, düğün mantarı olarak bilinmektedir. Shiitake Çin’de Xiang-gu (Xiang=aroma, gu=mantar) olarak bilinmekte ve dong-gu (kış mantarı) ile hua-gu (çiçek mantarı) olmak üzere 2 formu bulunmaktadır. Dong-gu taze halde daha kaliteli iken. Hua-gu’nun ise kurutulmuş formu daha pahalıdır. 4.2. Morfolojisi Shiitake mantarı şemsiye şeklinde şapka, lameller ve sap olmak üzere 3 kısımdan oluşur. Yuvarlak olan şapkanın büyüklüğü 5-10 cm arasında değişmektedir ve kenarları açık renkte, tepe kısmı siyaha yakın koyu kahverengidir. Etli kısım sert ancak esnektir. Mantarın genç döneminde önce beyaz veya açık kahverengi film şapkanın kenarları boyunca gözlenir ve şapka yüzeyinde küçük parçalar halinde kalır. Genç dönemde şapkanın dış yüzü içeri doğru kıvrıktır ve sapın alt kısmı arasında yumuşak bir zar ile kaplıdır. Büyüme sırasında bu zar parçalanır ve sapın etrafında halka şeklinde kalır, ancak zamanla gözle fark edilmez hale gelir. Şapkanın üzerinde ise özellikle kenarlarda bu zar bariz bir şekilde beyaz renkli olarak fark edilebilmektedir. Shiitake’nin lamelleri beyaz renklidir ve sayıca çok fazla olmayıp, merkez’den etrafa doğru radyal şekilde gelişmektedir. Basidium çubuk şeklindeve ucunda her biri bir basidiospor taşıyan 4 sterigmata bulunmaktadır. Basidiosporlar beyaz renkli, 5-6 mikron uzunluğunda, 2.5-3.5 mikron genişliğinde silindirik veya elipsoit şeklindedir. Sap yaklaşık 3-6 cm uzunluğunda ve şapkaya merkezi olarak bağlanmıştır. Lamellere yakın olan kısım beyaz ve orta kısma göre daha kalındır. Sapın alt kısmı da yine orta bölgeye göre daha kalın olup, renk alta doğru açık kahverengiye dönmektedir. 4.3. Yaşam Döngüsü Shiitake’nin yaşam döngüsü Tricholomatales’in tipik özelliklerini göstermektedir ve hymenium içerisinde basidiumları üretmesi karekteristiktir. İki faktörlü heterotallic bir tür olan Shiitake’nin lamelleri olgunlaştığında basidiosporları üretir. Tek bir tane Shiitake, milyonlarca spor üretebilir. Bu haploid sporlar doğada geniş bir alana yayılır ve çok az bir kısmı uygun bir yer ve koşul bularak çimlenebilir. Haploid sporların çimlenmesiyle homokaryon miseller gelişir. Homokaryon hifin Her hücresi bir çekirdek içerir ve hifler dallanarak gelişir. Homokaryon miseller tek başlarına mantar oluşturamazlar. Mantar oluşumu için iki ayrı cinsiyetteki homokaryon miselin bir araya gelmesi ve birleşerek sekonder misel adı verilen iki çekirdekli bir hücre olan dikaryon hifin oluşması gerekmektedir. Bu birleşme süresinde erime (Füzyon) işlemi sitoplazmada ortaya çıkmakta, çekirdekte herhangi bir şey olmamaktadır. Sekonder hif oluşurken hücre bölünmesinde kelepçe bağlantısı olarak adlandırılan bir şişlik oluşur ve bu kısım incelendiğinde primler ve sekonder hif kolaylıkla ayırt edilebilir. Dikaryotik misellerde arasında septum vardır ve her misel hücresinde 8 kromozom bulunmaktadır. Sekonder hif yeterli besinleri alarak primer hiften çok daha kuvvetli gelişir ve misel topağı oluşturmaya başlar, uygun koşullar altında bu topaklar primordiumu, ardından mantarı oluşturmak üzere gelişirler (Ito 1978, Lee 1980, Itavaara 1993). 5. TOHUMLUK MİSEL ÜRETİMİ Başarılı bir mantar üretimi için en önemli konulardan birisi, her şeyden önce yüksek kalitede mantar tohumluğuna sahip olmaktır. Shiitake üretmek isteyen bir kişi tohumluğunu özel firmalardan temin edebileceği gibi kendisi de hazırlayabilir. İleride de değinilecek olan sentetik kültür yoluyla Shiitake üretmek isteyen bir kişi bu yöntemle kuracağı bir işletmede kendi tohumluğunu kendisi üretebilir. Ayrıca bu tip bir işletmede tedarik edilecek alet ve ekipmanlarla sadece Shiitake’nin değil diğer bütün mantar türlerinin de (Agaricus bisporus, Auricularia spp., Flammulina velutipes, Ganoderma lucidium, Grifola frondosa, Pleurotus spp., Volvariella spp. vb.) tohumluğu veya yetiştirme ortamları hazırlanabilir, üretimleri gerçekleştirilebilir. Tohumluk misel üretimi için ilk yatırım maliyetinde önemli biryer tutan en önemli iki cihaz otoklav ve steril aşılama kabinidir. Bunun dışında, bir laboratuvarda maliyeti nispeten daha düşük ama bulunması gerekli diğer alet ve ekipmanlar kısaca; etüv, hassas terazi, çalkalayıcı, pH metre, haşlama kazanı, elek sistemi, buzdolabı, mikroskop, binoküler, ısıtıcılar, saf su aygıtı, sıvı azot tankı, bilgisayar, raflar, bunzen beki, cam malzemeler (cam tüp, kavanoz, şişe vb.), bisturi, ok uçlu iğne, öze, pamuk vb. sayılabilir. Shiitake’nin sentetik kültür yoluyla üretiminde yetiştiriciliğin bu yolla yapıldığı büyük işletmelerde oldukça büyük otoklavlar kullanılmaktadır. Bu bakımdan tohumluk misel üretiminde iç hacmi daha düşük kapasiteli bir otoklav tohum üretimi için yeterli olacaktır. Şekil 4.1. Doğada Shiitake’nin yaşam döngüsü 1. Şapka 2. Lamel 3. Hymenium 4. Basidium 5. Sterigma 6. Basidiospore 7. Spor çimlenmesi 8. Monokaryon misel 9. Dikaryon misel 10. Primordium teşekkülü 11. Meyve gelişimi a) monokaryon misel safhası b) dikaryotization (stoplazmik birleşme) c) dikaryon misel safhası d) meyve oluşumu e) mayoz bölünme) Tohumluk Misel üretiminde esas. Olarak Agaricus Bisporus tohumluğunun hazırlanmasındaki yol aynen bu mantar türünde de kullanılmaktadır. 5.1. Anaç Mantarların Seçimi ve Saf Kültürlerin Hazırlanması Tohumluk misel üretiminde ilk aşama anaç mantarların seçimidir. İki amaçla seçilecek olan mantarlar taze, çeşidin tipik özelliklerini gösteren, hastalıksız, yarası beresi olmayan, kısmen şapkasını açmamış olmalıdır. Bu şekilde seçilen mantarın sapı bir miktar kesildikten sonra steril kağıt, cam ya da alüminyum folyonun üzerine konularak 24°C’de etüvde inkübasyona bırakılır ve 2-3 gün sonra lamellerden dökülen sporların bulunduğu kağıt, olası virüs hastalıklarını önlemek amacıyla petri kabının içinde yine etüvde 70°C de bir saat tutularak aşılamaya hazır hale getirilir. Saf kültürün hazırlanmasında ikinci aşama besin ortamlarının hazırlanması ve sporların aşılanmasıdır. Shiitake sporlarının çimlenmesi ve misellerin gelişmesinde saf kültür besin ortamı olarak birçok ortam kullanılabilmesine karşın burada misellerin gelişmesi için son derece uygun bir besi yeri olan sadece PDA ortamının hazırlığından bahsedilmiştir. 5.1. Anaç Mantarların Seçimi ve Saf Kültürlerin Hazırlanması Tohumluk misel üretiminde ilk aşama anaç mantarların seçimidir. İki amaçla seçilecek olan mantarlar taze, çeşidin tipik özelliklerini gösteren, hastalıksız, yarası beresi olmayan, kısmen şapkasını açmamış olmalıdır. Bu şekilde seçilen mantarın sapı bir miktar kesildikten sonra steril kağıt, cam ya da alüminyum folyonun üzerine konularak 24°C’de etüvde inkübasyona bırakılır ve 2-3 gün sonra lamellerden dökülen sporların bulunduğu kağıt, olası virüs hastalıklarını önlemek amacıyla petri kabının içinde yine etüvde 70°C de bir saat tutularak aşılamaya hazır hale getirilir. Saf kültürün hazırlanmasında ikinci aşama besin ortamlarının hazırlanması ve sporların aşılanmasıdır. Shiitake sporlarının çimlenmesi ve misellerin gelişmesinde saf kültür besin ortamı olarak birçok ortam kullanılabilmesine karşın burada misellerin gelişmesi için son derece uygun bir besi yeri olan sadece PDA ortamının hazırlığından bahsedilmiştir. Buna göre; 300 gr soyulmuş ve dilimlenmiş patates 1.5 lt su içinde bir kapta kaynatılarak haşlanır ve süzülür. Ardından 20 gr dextroz ile 20 gr agar ilave edilip süzüntü 1 lt’ye tamamlanıp pH’sı 6.0-7.0’ye ayarlandıktan sonra tekrar ısıtılarak kaynama noktasında, petri kaplarına doldurularak otoklavda 121°Cde 25-30 dakika sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası kaplar steril aşılama kabinine alınarak burada ortamlara soğuduktan sonra ok uçlu bir iğneyle spor aşılaması gerçekleştirilir. Aşılamada kullanılacak 2. bir yol ise doku kültürü yöntemidir. Bu amaçla steril kabine alınan mantar elle koparılarak ikiye ayrılır ve iç dokudan alınan 0.5 xl.O cm ebadındaki bir parça yine petri kaplarındaki ortamlara aşılanır. Aşılama sonrası kültürler 24 °C deki iklim dolabında inkübasyona tabi tutulur ve yaklaşık 2-3 gün sonra sporlarda çimlenme başlar, 7 ile 9 cm çapındaki petrilerde gelişme 20-25 günde tamamlanmaktadır ve süre sonunda besin ortamının üzeri pamuk gibi Shiitake nin miselleriyle kaplanır. 5.2. Tohumluk Miselin Hazırlanması Yukarıda açıklanan şekilde hazırlanan miseller doğrudan üretimde kullanılamaz. Bunun en önemli nedeni ağar maddesinin çok pahalı oluşunun yanında, agarlı ortamın yetiştirme ortamlarına ekimi sırasında enfeksiyon riskinin daha yüksek oluşudur. Shiitake mantarının tohumluk misellerinin hazırlanmasında sardırma materyali olarak daha çok dal parçaları, talaş ile buğday, çavdar, darı gibi hububatların danelerinden yararlanılmaktadır. Tanegoma adı verilen ve meşe, kavak gibi ağaçların dallarından 1-1.5 cm çapında, 1.5-2.0 cm uzunluğunda çubuk şeklinde kesilen dal parçalarıyla talaş ortamı kültür kütüklerinin, hububat danelerinden hazırlanan miselleri ise sentetik ortamların aşılanmasında kullanılmaktadır. Dal parçalarının sterilizasyondan 1 gün önce suda bırakılması nem düzeylerinin artması bakımından varalı olacaktır. Kültür kütüklerinde talaş miseli tercih etmenin nedeni, hububat danelerine sardırılmış miselle yapılan aşılama sonrası karınca ve böcek gibi zararlıların hububatı yemesi ve aşılamanın etkinliğinin ortadan kalkmasından ileri gelmektedir. ‘ Talaş miseli hazırlamada pratik olarak 4/5 meşe talaşı+ 1/5 buğday kepeği kullanılabilir. Kuru kuruya iyice karıştırılan maddenin pH durumuna göre gerekli kireç ilavesi yapıldıktan sonra nem oranı % 60-65’e çıkarılmalıdır. Karışım; talaşın suyunu 1-2 saat emmesini sağladıktan sonra kullanılmalıdır. Dane miselin hazırlanmasında ise, işletmenin ihtiyacına göre değişmekle beraber burada 10 kg’lık bir miktar esas alınmıştır. Buna göre bir kaynatma kazanında 15 lt su kaynadıktan sonra 10 kg buğday haşlanır. Buğdayın haşlanma miktarı az olmamalı, ancak aşırı kaynatılmayla da buğdaylar patlatılmamalıdır. En iyi kaynatma süresi buğdayın yemeklik patates haşlanmasında olduğu gibi kabuklarının soyulmayıp ancak iç kıvamının yenecek hale geldiği zaman kadardır. Bu şekilde haşlanan buğday bir elekte süzülür ve içerisine kireçle çamurlaşmayı önlemek için 1-2 kg alçı ilave edilir. Yukarıda açıklanan şekilde hazırlanan her üç materyal de 1-1.5 lt’lik cam şişe veya kavanozlara ya da polipropilen torbalara 2/3 oranında doldurulup ağızları pamukla mühürlendikten sonra otoklavda 1.5-2 saat sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası şişeler steril aşılama kabinine getirilir. Burada UV ışığı altında 1 gün bekletildikten sonra daha önce hazırlanmış saf kültürlerden alınan yaklaşık 1-1.5 cm’lik misel gelişmiş agar parçaları şişelerin ağzı hafifçe açılarak ortamlara aşılanır. Her bir şişeye iki kültür aşılama, misellerin kısa sürede sarması bakımından daha iyidir. Aşılanması tamamlanan şişeler 24°Cdeki iklim dolabı veya odasında inkübasyona tabi tutulur ve şişe büyüklüğü ile kullanılan ortamın miktarına bağlı olarak 20-30 gün içerisinde miseller tamamen gelişecektir. Bu şekilde hazırlanan ortamlar ” ana kültür ” (tane misel için) adını almakta, yetiştirme ortamlarının direkt aşılanmasında kullanılabilmesine rağmen içinde bulunan agar nedeniyle pahalıya satılmakta, aslında ana kültürler yeni tohumların üretilmesinde yer almaktadır. Bir ana kültür şişesinden 50-60 yeni şişe aşılanabilmekte, bu aşılanan şişeler de yine ana kültür gibi değerlendirilerek, aşılandığında 2500-3000 adet yeni tohumluk misel şişesi hazırlanabilmektedir. Ancak, sürekli alt kültür yapma misellerde dejenerasyon olması sebebiyle de tercih edilmemeli, 3-4 alt kültürden sonra yeni saf kültürlerle çalışılmalıdır. Shiitake tohumluk miselleri hemen kullanılmayacaksa +4°C’de buzdolabı koşullarında saklanmalıdır. Saklama süresi 3-4 aydır ve bu sürenin sonunda hububat danelerinde yumuşamaya paralel olarak misellerde yaşlanma görülecek ve tohumlar elden çıkacaktır. Sırasıyla talaş misel ile odun parçalarındaki misellerin saklanma süresi biraz daha uzundur. Saf kültürlerde +4°C’de muhafaza edilmelidir. Cam tüplerde hazırlanan ortamların petri kaplarında hazırlanan ortamlara oranla dayanımları daha uzun olup, petri kaplarının etrafı plastik filmle çevrilse bile içinde bulunan besi yerlerinin zamanla kuruması nedeniyle bu saf kültürlerden de zamanla alt kültür yapmak faydalı olacaktır.
İSTİRİDYE MANTAR 